Sujet de thèse : Mise au point de dispositifs microfluidiques pour détecter les bactéries/sepsis par nanoluminescence, Orsay

Lieu de travail

Intitulé du sujet : Mise au point de dispositifs microfluidiques pour détecter les bactéries/sepsis par nanoluminescence

L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a récemment déclaré que ‘la résistance aux antimicrobiens (RAM) représente une menace croissante pour la santé publique et la sécurité mondiales’. Au moins 50 000 décès annuels, rien qu’en Europe et aux États-Unis, sont dus à des bactéries résistantes. De nouveaux mécanismes de résistance continuent d’apparaître et de se propager, sapant la capacité du monde à traiter les maladies infectieuses courantes. Le besoin de nouveaux agents antimicrobiens est essentiel. La surveillance de l’émergence et de la propagation de la résistance aux médicaments est un autre élément essentiel de la stratégie mondiale de lutte contre la RAM.

Les médecins doivent donc proposer la meilleure thérapie aux patients par (i) l’identification de la présence ou non d’une infection bactérienne et, si oui, (ii) l’identification des souches de bactéries impliquées et de leur éventuel profil de résistance aux antibiotiques. Par conséquent, la mise au point de nouveaux tests rapides, peu coûteux et fiables pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) est devenue une priorité urgente. Jusqu’à présent, la méthode de diagnostic de référence pour les infections graves se fait par culture nécessitant 2 à 5 jours avec une faible sensibilité (30 à 50 % en ce qui concerne le résultat clinique).

Des méthodes alternatives ont été développées pour réduire le temps et l’échantillon nécessaires à une mesure fiable en détectant la présence de cellules par la quantification des niveaux d’oxygène ou la présence de séquences d’acides nucléiques spécifiques. L’utilisation de dispositifs microfluidiques s’est développée rapidement en raison des faibles volumes d’échantillons requis, de la possibilité de multiplexage et du taux de croissance accru des bactéries dû à la grande disponibilité de l’O2. Cependant, la détection du petit nombre de cellules qui en résulte reste un défi, car les méthodes actuelles sont soit coûteuses (spectroscopie d’impédance), soit manquent de robustesse et de reproductibilité (SPR).

Une première génération de nanoparticules sensibles aux bactéries (mais non spécifiques) a été développée et peut détecter rapidement (généralement 2 à 6 h, selon la concentration initiale) une faible croissance bactérienne (<1000 CFU / ml) [Biosensors and Bioelectronics, 2016, 75, 320]. Ces nanoparticules sont non seulement plus sensibles que les capteurs moléculaires actuellement utilisés, mais aussi plus sensibles et plus fiables que les mesures de densité optique classiques. Elles permettent de surveiller en continu et en temps réel la croissance bactérienne sur de longues périodes et sur de petits volumes et peuvent donc être utilisées pour des applications à haut débit telles que le dépistage de la présence de souches résistantes aux antibiotiques.

Des particules ratiométriques pour la détection du pH et la détection de la croissance bactérienne sont actuellement en cours de développement. De nouvelles sondes moléculaires et/ou des QDs sélectifs pour certaines souches microbiennes devront être développés et caractérisés (ciblant par exemple les peptides ou les hydrates de carbone des membranes des bactéries). Des microdispositifs fluidiques de première génération doivent être conçus. Ce projet de thèse se concentre sur le développement de dispositifs hautement sensibles grâce à des fluorophores ou objets nanoluminescents (organiques ou inorganiques).

The World Health Organization (WHO) recently reported that “Antimicrobial resistance (AMR) represents a growing threat to global public health and security’. At least 50000 annual deaths, across Europe and the US alone, are due to antimicrobial-resistant infections. New resistance mechanisms continue to emerge and spread, undermining the world’s ability to treat common infectious diseases. The need for new antimicrobial agents is essential. Surveillance to monitor the emergence and spread of drug resistance is another crucial component of the global strategy to combat AMR.

Thus physicians need to propose the best therapy to patients through (i) identification of the presence or not of bacterial infection and if yes (ii) identification of the bacteria strains involved and their eventual antibiotic resistance profile. Consequently, development of novel rapid, low cost and reliable assays for Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) has thus become an urgent priority. Up to now, the gold standard diagnosis methodology for severe infections is done by blood culturing requiring 2-5 days with a low sensitivity (30 to 50% with regard to clinical outcome).

Alternative methods have been developed to reduce the amount of time and sample necessary for a reliable measurement by detecting the presence of whole cells by quantifying the oxygen levels or the presence of specific nucleic acid sequences. The use of microfluidic devices has been developing rapidly because of the low sample volumes required, the possibility for multiplexing and the increased growth rate of bacteria due to the high O2 availability. Yet, the detection of the resulting small number of cells remains a challenge since current methods are either expensive (impedance spectroscopy) or lack robustness and reproducibility (SPR).
A first generation of bacteria-sensitive (but non-specific) nanoparticles has been developed and can rapidly detect (typically 2-6 h, depending on the initial concentration) low bacterial growth (<1000 CFU / ml) [Biosensors and Bioelectronics, 2016, 75, 320]. These nanoparticles are not only more sensitive than the molecular sensors currently in use, but also more sensitive and reliable than conventional optical density measurements. They allow continuous and real- time monitoring of bacterial growth over long periods of time and on small volumes and can thus be used for high throughput applications such as screening for the presence of antibiotic-resistant strains. Ratiometric particles for pH-sensing and bacteria growth detection are currently under development.
New molecular probes and/or QDs selective for certain strains have to be developed and characterized (for instance by targeting peptides or carbohydrates from bacteria membranes). First-generation fluidic microdevices shall be designed. This thesis project focuses on the development of highly sensitive devices thanks to fluorescent molecular probes or nano-luminescent objects (organic or inorganic).

This project gathers 2 academic partners and 1 company with complementary expertise. Rachel Méallet-Renault (ISMO CNRS UMR8214, Univ. Paris-Saclay) is a physical-chemist specialized in fluorescence and will be supervising the PhD. She has experience in project management (LabeX, DIM …) and will provide the necessary experience to coordinate this multidisciplinary project. She will oversee surface grafting, surface calibration, fluorescence and microscopy imaging investigations (without and with bacteria). Farah Savina (research engineer, ISMO) will contribute to surfaces characterizations.

ISMO has a Shimadzu UVvis spectrophotometer, equipped with an integrating sphere (280-1200nm) and a fluorimeter. A life measurement module is available, as well as a platform for physico-chemical characterisation. A multimodal fluorescence microscopy platform, a L1, two L2 are also available at the Centre de Photonique pour les Matériaux et la Biologie.

PPSM will provide all means to design, synthetize and characterize the new molecular probes and nano-particles.
Isabelle Leray (co-supervisor PPSM, UMR 8531, ENS Paris-Saclay), Cédric Mongin and their collaborators will provide their expertise in molecular chemistry, quantum dots synthesis and functionalization. The PhD candidate will be coached to design and fabricate millifluidics devices (PPSM, IDA platform) as well as microfluidic systems, (within the RENATECH network).

Antoine Pallandre (collaborator, ICP CNRS UMR8000, Univ. Paris Saclay) in connection with the Elvesys Company (potential collaborator).

Antoine Pallandre (collaborator, ICP CNRS UMR8000, Univ. Paris Saclay) will give advice for microfluidic devices design as well as sample preparation parts.
Ludivine Houel-Renault (CPBM, ISMO, Univ. Paris Saclay) will bring her expertise for bio-imaging and will train the PhD candidate for pathogenic bacteria tests.

Cédric Mongin (MCF – ENS Paris-Saclay) sera également co-encadrant. Le ou la doctorant.e bénéficiera de réunions hebdomadaires avec ses encadrantes. Il ou elle devra produire des rapports bibliographiques (au moins une fois par mois) et des compte-rendus de recherche (diapositives et rapports hebdomadaires).

Un.e chimiste ou un.e physicien.ne ayant de solides bases en physico-chimie et particulièrement en spectroscopie ou microscopie serait particulièrement apprécié.e.

A chemist or a physicist with solid bases in physico-chemistry and particularly in spectroscopy or microscopy would be particularly appreciated.